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超微量分光光度計常見的用途
分光光度計是一類很重要的分析儀器 ，無論在物理學、化學、生物學、醫學、材料學、環境科學等科學研究領域 ，還是在化工、醫藥、環境檢測、冶金等現代生產與管理部門 ，紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應用。分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
超微量分光光度計已成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
核酸的定量
核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈ＤＮＡ，以及ＲＮＡ。核酸的最高吸收峰的吸收波長２６０ ｎｍ。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：１ＯＤ 的吸光值分別相當于５０μｇ／ｍｌ的ｄｓＤＮＡ，３７μｇ／ｍｌ的ｓｓＤＮＡ，４０μｇ／ｍｌ的ＲＮＡ，３０μｇ／ｍｌ的Ｏｌｉｇ。測試后的吸光值經過上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。
事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如德國伯赫Ｃｏｌｉｂｒｉ超微量分光光度計的準確度≤１．０％（１Ａ）。這樣多次測試的結果在均值１．０％左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的ｐＨ值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移，因此建議使用ｐＨ值一定、離子濃度較低的緩沖液，如ＴＥ，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于０．１Ａ，吸光值最好在０．１－１．５Ａ。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如Ａ２６０／Ａ２８０的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是２８０ｎｍ。純凈的樣品，比值大于１．８（ＤＮＡ）或者２．０（ＲＮＡ）。如果比值低于１．８ 或者２．０，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。Ａ２３０表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸Ａ２６０／Ａ２３０的比值大于２．０。Ａ３２０檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，Ａ３２０一般是０。
蛋白質直接定量
這種方法是在２８０ｎｍ波長，直接測試蛋白。選擇Ｗａｒｂｕｒｇ 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在一些雜質，一般要消除３２０ｎｍ 的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求Ａ２８０的吸光值至少大于０．１Ａ，最佳的線性范圍在１．０－１．５ 之間。實驗中選擇Ｗａｒｂｕｒｇ 公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上，只要觀察Ａ２８０的吸光值的變化范圍不超過１％，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Ｗａｒｂｕｒｇ 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如ＤＮＡ的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質定量
蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。
比色方法一般有ＢＣＡ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｌｏｗｒｙ 等幾種方法。
Ｌｏｗｒｙ 法：以最早期的Ｂｉｕｒｅｔ 反應為基礎，并有所改進。蛋白質與Ｃｕ２ 反應，產生藍色的反應物。但是與Ｂｉｕｒｅｔ 相比，Ｌｏｗｒｙ 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含ＥＤＴＡ，Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００，ａｍｍｏｎｉａ ｓｕｌｆａｔｅ 等物質的蛋白不適合此種方法。
ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｎｅ ａｃｉｄ ａｓｓａｙ）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Ｃｕ２ 反應產生Ｃｕ ，后者與ＢＣＡ形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在５６２ｎｍ波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應后形成的化合物非常穩定。相對于Ｌｏｗｒｙ法，操作簡單，敏感度高。但是與Ｌｏｗｒｙ法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰５９５ｎｍ。其最大的特點是，敏感度好，是Ｌｏｗｒｙ 和ＢＣＡ 兩種測試方法的２ 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定１小時，方便結果；而且與一系列干擾Ｌｏｗｒｙ，ＢＣＡ 反應的還原劑（如ＤＴＴ，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Ｋｅｌｌｅｒ等測試人奶中的蛋白，結果Ｌｏｗｒｙ，ＢＣＡ 測出的濃度明顯高于Ｂｒａｄｆｏｒｄ，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Ｌｏｗｒｙ測試細胞勻漿中的蛋白質，以ＢＳＡ作標準品，濃度１．３４ｍｇ／ｍｌ，以ａ球蛋白作標準品，濃度２．６４ｍｇ／ｍｌ。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應后１０１１分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標準樣品），都必須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液ＰＨ值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。
ＯＤ ６００
實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。ＯＤ６００是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之后定量培養后的含菌培養液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現菌液的ＯＤ值出現負值，原因是采用了顯色的培養基，即細菌培養一段時間后，與培養基反應，發生變色反應。另外，需注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態。
超微量分光光度計的主要結構
各種型號的分光光度計基本結構都相同，由如下五種部分組成：
１）光源（鎢燈、鹵鎢燈，氫弧燈，氘燈、氙燈或激光光源）；
２）單色器（濾光片、棱鏡、光柵、全息柵）；
３）樣品吸收池；
４）檢測系統（光電池、光電管、光電倍增管）；
５）信號指示系統（檢流計、微安表、數字電壓表、示波器、微處理機顯像管）。
光源－單色器－樣品吸收池－檢測系統－信號指示系統。
（文章來源于互聯網）
