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表觀遺傳修飾在多種生物和病理過程中起著關鍵作用，其中５－甲基胞嘧啶（５ｍＣ）被認為是腫瘤發生和進展的早期分子事件，并已成為一個非常有前景的生物標志物。近年來，５－羥甲基胞嘧啶（５ｈｍＣ）作為５ｍＣ的氧化產物，在正常哺乳動物生長和發育中也扮演著重要角色，并與癌癥和神經疾病等疾病相關，顯示出作為癌癥診斷理想生物標志物的巨大潛力。然而，由于５ｈｍＣ水平比５ｍＣ低約１４倍，且其結構與Ｃ和５ｍＣ相似，使得５ｈｍＣ的定量檢測更具挑戰性。
近日，上海交通大學生物醫學工程學院彭小煥博士為第一作者、徐宏研究員為通訊作者在《Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ》期刊發表題為＂Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５ｈｍＣ ｂｙ ｑＰＣＲ ｖｉａ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ： Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ＂的科研成果，研究建立了一種名為ＥＤＤ－５ｈｍＣ的５ｈｍＣ定量方法，該方法通過結合酶切（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）和生物脫氨（Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）策略，利用ｑＰＣＲ平臺實現對片段特異性ＤＮＡ序列中５ｈｍＣ的極高特異性、高靈敏度和臨床適用性的定量分析。該方法首次在結直腸癌組織和配對的癌旁組織中檢測了５ｈｍＣ水平，以評估其區分結直腸癌的能力，結果顯示單基因Ｓｅｐｔｉｎ９的ＲＯＣ曲線下面積高達８２．８％，Ｓｅｐｔｉｎ９和Ｓｙｎｄｅｃａｎ－２（ＳＤＣ２）組合的ＲＯＣ曲線下面積為８３．６％，表明ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法是一種具有臨床應用前景的準確定量５ｈｍＣ水平的方法。
標題：Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５ｈｍＣ ｂｙ ｑＰＣＲ ｖｉａ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ： Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ（通過結合酶切和脫氨作用的ｑＰＣＲ對５ｈｍＣ片段特異性定量檢測：極高特異性、高靈敏度和臨床適用性）
期刊：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
日期：２０２５－１－１３
技術平臺：擴增子ＡＰＯＢＥＣ偶聯ＤＮＡ羥甲基化測序（ＡＣＥ－ｓｅｑ）、ｑＰＣＲ等
準確鑒定和定量５ｈｍＣ有助于闡明其在基因表達和疾病發病機制中的功能，目前的５ｈｍＣ分析方法在臨床應用中，存在假陽性結果的風險以及靈敏度不足的問題。本研究建立了一種靶向片段特異性ＤＮＡ序列的５ｈｍＣ定量方法，該方法具有極高的特異性、高靈敏度和臨床適用性－－ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法，該方法通過酶切富集糖基化的５ｈｍＣ，然后利用ＡＰＯＢＥＣ（載脂蛋白Ｂ ｍＲＮＡ編輯催化多肽樣）介導的脫氨基作用，有效區分各種胞嘧啶（Ｃ）修飾狀態，實現了極高特異性的５ｈｍＣ定量，使非特異性擴增減少８Ｍ倍。此外，ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的非破壞性生物處理過程表現出高靈敏度，最低檢出限（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＬＯＤ）達到３０ ａＭ。研究人員利用該方法首次檢測了結直腸癌組織和匹配的癌旁組織中的５ｈｍＣ水平，以評估其區分結直腸癌的能力，單基因Ｓｅｐｔｉｎ９的受試者工作特征曲線下面積高達８２．８％，Ｓｅｐｔｉｎ９和Ｓｙｎｄｅｃａｎ－２（ＳＤＣ２）組合的曲線下面積為８３．６％，表明ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法是一種具有臨床應用前景的準確定量５ｈｍＣ水平的方法。
研究摘要
研究方法
研究中基于ＡＣＥ－ｓｅｑ分析提出的ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法包括四個步驟：
（１）通過Ｔ４－β－葡萄糖轉移酶（Ｔ４ ＢＧＴ）和尿苷二磷酸葡萄糖（ＵＤＰ－葡萄糖）反應，對５ｈｍＣ進行高效無損傷的葡萄糖基化，生成５ｇｈｍＣ；
（２）應用葡萄糖基－５－羥甲基胞嘧啶敏感的限制性內切酶（ＧＳＲＥｓ）消化Ｃ和５ｍＣ，富集完整的５ｇｈｍＣ目標；
（３）通過ＡＰＯＢＥＣ脫氨基將Ｃ和５ｍＣ轉化為尿嘧啶（Ｕ），而５ｇｈｍＣ仍被讀作Ｃ；
＊以上３步驟均為ＡＣＥ－ｓｅｑ測序的基本原理
（４）使用特異性引物和ＴａｑＭａｎ探針結合并擴增５ｇｈｍＣ以產生熒光信號。該方法基于ｑＰＣＲ平臺，通過酶切和脫氨基的雙重作用，有效地區分５ｈｍＣ與Ｃ和５ｍＣ，確保了極高的特異性和靈敏度。
研究結果
特異性和靈敏度：ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法通過四組不同預處理的人工合成線性雙鏈ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）驗證了其特異性，結果顯示該方法能夠顯著減少非特異性擴增，將非特異性擴增減少了超過八百萬倍，檢測限達到３０ ａＭ。
臨床樣本驗證：使用未甲基化ＨＣＴ１１６ ＤＫＯ ｇＤＮＡ、甲基化ＨＣＴ１１６ ｇＤＮＡ和人腦基因組作為模型樣本，選擇了ＥＧＦＲ基因作為目標基因進行驗證。結果顯示，只有經過Ｔ４ ＢＧＴ－ＡＰＯＢＥＣ或Ｔ４ ＢＧＴ－ＭｓｐＩ－ＡＰＯＢＥＣ聯合處理的人腦基因組產生了特異性ＰＣＲ擴增。
臨床診斷性能：對２５例結直腸癌患者和配對的癌旁組織樣本進行分析，結果顯示Ｓｅｐｔｉｎ９基因的５ｈｍＣ水平在ＣＲＣ組織中顯著高于非腫瘤組織（Ｐ ＜ ０．０００１），表明Ｓｅｐｔｉｎ９基因的特定片段５ｈｍＣ水平有潛力作為ＣＲＣ的診斷標志物（ＡＵＣ ＝ ０．８２８）。
ＡＣＥ－ｓｅｑ在本研究中的作用
ＡＣＥ－ｓｅｑ（ａｍｐｌｉｃｏｎ ＡＰＯＢＥＣ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）在本研究中用于確定ＨＣＴ１１６細胞中與Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２相關的５ｈｍＣ信息，以及ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態。這些信息對于選擇特定的ＤＮＡ片段進行ＥＤＤ－５ｈｍＣ分析至關重要，確保研究中所使用的ＤＮＡ片段具有高ＤＮＡ甲基化富集區域，與結直腸癌（ＣＲＣ）強相關。通過ＡＣＥ－ｓｅｑ獲得的數據為ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法的驗證和應用提供了準確的５ｈｍＣ修飾信息，從而提高研究的準確性和可靠性。
重要圖形
（１）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ表征ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態
為了檢驗ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對實際樣本的可行性，選擇三種模型樣本進行驗證：未甲基化的ＨＣＴ１１６ ＤＫＯ ｇＤＮＡ（雙敲除）、甲基化的ＨＣＴ１１６ ｇＤＮＡ和人類大腦基因組。首先選擇在人類大腦基因組中富含５ｈｍＣ的表皮生長因子受體（ＥＧＦＲ）基因作為目標基因，對選定檢測片段的基因組進行ＣｐＧ島預測，并通過（ａｍｐｌｉｃｏｎ ＡＰＯＢＥＣ偶聯表觀遺傳測序）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ對ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態進行表征。測序結果顯示，ＥＧＦＲ片段（ｃｈｒ７：５５０８２６１０?５５０８２７２４，稱為ＥＧＦＲ ｇｅｎｅ ６８６３５）在人類大腦基因組中高度富集（平均４４．５６％），而在未甲基化的ＨＣＴ１１６ ＤＫＯ ｇＤＮＡ和甲基化的ＨＣＴ１１６ ｇＤＮＡ中含量較低（平均分別為０．１８％和０．６６％）。
圖１：用于ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測的候選ＥＧＦＲ位點。
（２）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ確定ＨＣＴ１１６細胞中目標位點對應的５ｈｍＣ信息
通過ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ確定了ＨＣＴ１１６細胞中位點對應的５ｈｍＣ信息，最終選定的序列片段為ｃｈｒ１７：７７３７３３４２?７７３７３４３７、ｃｈｒ８：９６４９４０９３?９６４９４２１５和ｃｈｒ８：９６４９４０３９?９６４９４１１１，分別命名為Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９，這些片段位于研究團隊先前研究中鑒定的高ＤＮＡ甲基化富集區域，與結直腸癌（ＣＲＣ）強相關。
圖２：ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法中使用的Ｓｅｐｔｉｎ９（Ａ）、ＳＤＣ２ ３１３（Ｂ）和ＳＤＣ２ ２３９（Ｃ）的最終選定位點。
（３）ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２的分析性能和臨床診斷性能
為了評估ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的靈敏度，通過２倍系列稀釋ＨＣＴ１１６基因組ＤＮＡ來評估已建立檢測法的分析性能，其中羥甲基化ＤＮＡ的理論ｉｎｐｕｔ拷貝數通過ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ獲得的５ｈｍＣ比例計算得出。分析結果表明，對于Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９，隨著羥甲基化ＤＮＡ濃度降低，Ｃｔ值逐漸增加。羥甲基化拷貝數與Ｃｔ值之間的關系分別為Ｒ2＝０．９９、Ｒ2＝０．９９和Ｒ2＝０．９５，這突出了ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的定量分析能力。
使用含有１０、１０和３０個拷貝／反應的Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９羥甲基化ＤＮＡ的樣本，進行了２０次重復檢測，以研究已建立檢測法的ＬｏＤ。結果表明在２０次重復反應中，Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９呈陽性的概率分別為９５％、１００％和１００％，表明Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２ ３１３和ＳＤＣ２ ２３９的檢測靈敏度分別約為１０、１０和３０個拷貝／反應，得出的ＬｏＤ約為３０ ａＭ，高于先前報道１１３．７ ａＭ靈敏度的５ｈｍＣ檢測方法。因此，本研究建立優化后的ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法表現出高靈敏度、特異性、穩定性和可重復性。
圖４：ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２的分析性能。
易小結
ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的建立，能夠在ｑＰＣＲ平臺上以極高的特異性和高靈敏度準確定量特定片段的５ｈｍＣ水平。該方法顯著減少了假陽性信號，提高了檢測靈敏度，實現了約３０ ａＭ的最低檢出限（ＬｏＤ）。同時，該方法首次證明了檢測單個基因Ｓｅｐｔｉｎ９中的特定５ｈｍＣ片段作為ＣＲＣ的新表觀遺傳生物標志物的巨大潛力，其ＡＵＣ高達８２．８％。未來，通過擴展其應用到其他疾病和研究更多標志物，ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法可能為與５ｈｍＣ水平差異相關的疾病提供有效的臨床檢測和驗證研究的新工具。
參考文獻：
Ｐｅｎｇ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５ｈｍＣ ｂｙ ｑＰＣＲ ｖｉａ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ： Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２０２５ Ｊａｎ １３． ｄｏｉ： １０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．４ｃ０５１４７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３９８０４２１４．
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